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1、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)備2)。空白孔加100μL(見試劑準(zhǔn)備第二步最后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC溫育2小時(shí)。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC溫育1小時(shí)。
4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液完全甩干。自動(dòng)洗板機(jī)亦可。
5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC溫育30分鐘。
6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。
7、 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC避光顯色(反應(yīng)時(shí)間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止)。
8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。
9、 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。因此，一次加樣時(shí)間(包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品)最好控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。
4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗(yàn)過程中。
5、 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
6、 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7、 如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。