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1、 加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標準品(見試劑準備2)。空白孔加100μL(見試劑準備第二步最后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標板加上覆膜，37oC溫育2小時。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。
3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標板加上覆膜，37oC溫育1小時。
4、 棄去孔內液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動洗板機亦可。
5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC溫育30分鐘。
6、 棄去孔內液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。
7、 每孔加底物溶液90μL，酶標板加上覆膜，37oC避光顯色(反應時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。
8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。
9、 在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。
注意：
1、 試劑準備：準備一次實驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。
2、 加樣：實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時間(包括標準品及所有樣品)最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發，洗板后應盡快進行下步操作，任何時侯都應避免酶標板處于干燥狀態，同時應嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實 驗過程中。
5、 反應時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘觀察一次)，如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過強從而影響酶標儀光密度讀數。
6、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
7、 如果實驗室內濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。